免疫组化染色方法之SP法 生物探索

　　免疫组织化学的基本原理免疫组化sp法是利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法，因此有不少医药研发外包服务公司例如美迪西，提供免疫组化染色服务。SP法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法，是常见的一种免疫组染色方法。

　　1、SP法的免疫组化sp法原理

　　链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S－P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

　　2、SP法基本染色方法

　　（1）、石蜡切片脱蜡至水；

　　（2）、3％H202室免疫组化sp法温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；

　　（3）、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）；

　　（4）、5～10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜；

　　（5）、PBS冲洗，5分钟×3次；

　　（6）、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1％BSA－PBS稀释），37℃孵育10～30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟；

　　（7）、PBS冲洗，5分钟×3次；

　　（8）、滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟；

　　（9）、PBS冲洗，5分钟×3次；

　　（10）、显色剂显色（DAB或AEC）；

　　（11）、自来水充分冲洗，复染，封片。

　　免疫组化是一个多步骤、多条件的复杂过程，每一步骤都会影响最终的结果，因为每一步骤都有其特定的条件，应严格按照特定的条件进行操作。